Изолиране на инвертаза от хлебни дрожди
Здравейте колеги!
Ето на какво попаднах при разучаването на ензима. Може на някой ентусиаст да му е полезно! ;)
Ензимът инвертаза (наричан още захараза) разгражда захарозата до глюкоза и фруктоза. Получава се инвертна захар, откъдето идва и името на ензима.
Наименованието на инвертазата по ензимната номенклатура е вета-D-фруктофуранозид-фруктохидролаза.
Дрождите (в частност хлебните) имат способността да натрупват в клетките си големи количества ензим, поради което може да се използват като източник за получаване на препарат на инвертаза. За целта обаче е необходимо дрождевите клетки да се поставят при условия, при които единствен компонент на хранителната им среда е захарозата. Това води до индуциране на образуването на инвертаза и до нейното натрупване в големи количества.
Ферментация на захари от хлебните дрожди
В три чаши от 100 ml са поставени по 40 ml вода Във всяка от тях са разтворени съответно по 10 g лактоза, фруктоза и захароза. Към всички се добавя 1 g мая (хлебни дрожди). Пробите се загряват до 40 °C.
Очевидно дрождите не ферментират лактозата. Умерена ферментация протича в чашата с фруктоза. Най-интензивно протича ферментацията в чашата, съдържаща захароза.
Ензимът е вътрешноклетъчен и се натрупва между клетъчната стена и клетъчната мембрана. За да се изолира, е необходимо да се разруши клетъчната стена. Това може да стане чрез механично стриване на клетките; чрез автолиза (при 45° С за 2 h); чрез обработка с толуол или с бензол; чрез обработка с ултразвук; при дълбоко замразяване с течен азот; чрез дезинтеграция (метод за разрушаване целостта на микробните клетки с помощта на специални апарати (дезинтегратори). След разрушаването на клетъчната стена и отделянето на биомасата ензимът остава в разтвора. Разтворът може да се използва като готов препарат на инвертаза, но е много разреден и е необходимо да се концентрира или ензимът да се утаи чрез различни методи. Най-често се прилага утаяване с етилов алкохол. Утаеният белтък, който съдържа ензима инвертаза, се отделя чрез центрофугиране и се разтваря в дестилирана вода, към която се прибавя глицерол. Целта е да се повиши стабилността на ензима. В разтвор на глицерол препаратът на инвертазата може да се съхранява до 18 месеца в хладилник с минимални загуби на активността му.
Указания за практическа работа:
А/ Необходими материали: Хлебни дрожди, захароза, кварцов пясък, дестилирана вода, 96°-ов етанол, глицерол, 10% NaOH, 5% CuSO4.
Б/ Ход на опита: В конични колби от 300 ml се поставят по 30 g хлебни дрожди и се суспендират с 30 ml 20%-ов разтвор на захароза. Добре е колбите да се поставят на клатачка за около 1,5 h (ако няма клатачка, необходимо е суспензията периодично да се разбърква за по-добра аерация). След обогатяването на дрождите с инвертаза, сместа се центрофугира за отделяне на клетките. Те се прехвърлят с малко вода в хаванче, прибавя се кварцов пясък и се стриват около 5—10 min, за да се разрушат клетъчните стени. Сместа се прехвърля в центрофужни епруветки, след което кварцовият пясък и останалата биомаса се смива с вода в същите епруветки.
Центрофугира се за 10 min при 6000 min-1. След отделяне на биомасата течността над утайката внимателно се измерва и се прехвърля в бехерова чаша от 200 ml, поставена в ледена баня. За утаяване на ензима се прибавя внимателно, по стените на чашата и при постоянно разбъркване, 1,5 обема етанол, охладен до —5 °С. След прибавяне на цялото количество етанол сместа се бърка още 10 min и се центрофугира при 1000 min-1 за 10 min. Течността се излива внимателно, получената утайка се разтваря в— 5—6 ml студена дестилирана вода и се прибавят 2—3 ml глицерол. Полученият глицеролов препарат на инвертаза се съхранява в хладилник.
В две епруветки се наливат по 5 ml 10%-ов разтвор на захароза. Към първата се прибавя 1 ml вода, а към втората — 1 ml от получения препарат на инвертаза.
През 10 min се вземат проби и се анализират за редуциращи захари.
